成像并评估胚胎、卵母细胞和干细胞
2020-01-11

成像并评估胚胎、卵母细胞和干细胞

本发明提供了用于确定一个或多个胚胎或多潜能细胞的发育潜力和/或一个或多个胚胎或多潜能细胞中的染色体异常的存在的方法、组合物和试剂盒。这些方法、组合物和试剂盒在体外确定在人类中治疗不育症中最有用的胚胎和卵母细胞中有用。

几何约束

图3是显示从I细胞胚胎(合子)成功发育为胚泡的百分比的柱状图。4个不同实验的过程中,通过时差显微术观察总共100个胚胎直到第5天或第6天。显示了达到每个标明的阶段(8细胞、4至7细胞、2至3细胞和I细胞)的细胞的百分比。

收集时差图像用于随后的细胞形态学分析,包括下列细胞参数中的至少一个的测量:第一次胞质分裂的持续时间,第一次和第二次细胞分裂之间的时间间隔以及第二次和第三次细胞分裂之间的时间间隔。图中显示的图像是在多达5或6天每5分钟以I秒的曝光时间获取的。如下文更加详细描述的,第一次胞质分裂通过常在受精后一天发生并且持续约14分钟。第一次和第二次细胞分裂通常间隔平均约11小时。第二次和第三次细胞分裂通常间隔平均约I小时。因此,成像是在受精后持续约36小时(加或减几小时)的一段时间。

将胚胎从培养基和成像系统移出并且收集为用于基因表达分析的单个胚胎或单个细胞(卵裂球)。每个板通常包含胚胎的混合物,一些在收获的时候达到了所期望的发育阶段而其他的在较早的发育阶段停滞或者广泛破碎。在收获的时候达到了所期望的发育阶段的那些被分类为“正常的”,而停滞的那些被认为是“不正常的”。例如,当为了收集样品将一个板的胚胎在第二天晚期从成像位置移出,已经达到4细胞期并且超过的任何胚胎将被定义为正常的,而没能达到4细胞期的那些将被标记为停滞的。将这些停滞的胚胎按照它们开始停滞的发育期分类,以使在第2天晚期仅具有2个胚泡的胚胎将被分析为停滞的2细胞胚胎。在样品收集的时候小心排除形态学上似乎是死亡的并且有孔的胚胎(例如退化的卵裂球)。仅显示活着的胚胎(正常的和停滞的两种)被用于基因表达分析。然而,可能的是收集的时候显示正常的胚胎如果它们被允许生长至较晚期的话可能最终停滞。通过定量RT-PCR(qRT-PCR)进行代表这些种类中的每一种的胚胎的基因表达分析。以大约24小时的间隔,从单个成像系统收集胚胎用于高通量的qRT-PCR基因表达分析,具有对96个样品测定的多达96个基因的多路反应。使用FluidigmB1mark系统进行基因表达分析,其可以纳升的量实现多达9216个同时发生的以TaqMan测定为基础的qRT-PCR反应。

如正文中所讨论的,一旦胚胎被建模,我们就可以提取动态显像参数,例如胞质分裂的持续时间和有丝分裂之间的时间。我们的细胞追踪软件之前被应用于Matlab并且估算时间在每张图像两秒至半分钟的范围内(取决于粒子的数目)。我们现有的软件版本被应用于C并且计算时间取决于粒子的数目在I至5秒的范围内。

通过自动分析证实成像参数

胚胎基因活化。本方法是至少部分以不正常的发育停滞的胚胎在EGA(胚胎基因活化)发生之前的头三次分裂期间通常表现出异常胞质分裂和有丝分裂时间的发现为基础的。这表明胚胎发育的命运主要由母系遗传决定,一个与由Hardy等人在200134中进行的人类植入前发育的数学模型显著一致的发现。而且胞质分裂和有丝分裂的异常与调节miRNA生物发生和母系mRNA遮蔽、储存和再活化的基因中母系转录物的降低的水平强烈相关。miRNA通过促进不同生物过程中的mRNA降解来调节翻译,包括生物发育和分化(Blakaj,A.&Lin,H.(2008)J.B1l.Chem.283:9505-9508;Stefani,G.&Slack,F.J.(2008)Nat.Rev.Mo1.CellB1l.9:219-230)。来自模式生物的增加的证据显示miRNA可以是在早期胚胎中母系转录物降解的关键调节因子(Bettegowda,A.等人(2008)Reprod.Fertil.Dev.20:45-53)。因此,miRNA生物发生上的缺陷将很可能导致不正常的胚胎发育,另一方面,不能正确管理母系mRNA同样导致不良胚胎发生。哺乳动物卵母细胞合成在母亲生产前支持早期胚胎生长所需要的大量母系RNA转录物。这些转录物被抑制并且贮存一段延长的时间,直到它们在受精之后被再活化。这一母系RNA管理程序中的缺陷将可能影响母系转录物的量和质量并且因此损害成功发育的机会。

可通过本发明的方法测定的胚胎的实例包括I细胞胚胎(也称为合子)、2细胞胚胎、3细胞胚胎、4细胞胚胎、5细胞胚胎、6细胞胚胎、8细胞胚胎等等,通常高达16细胞胚胎并且包括16细胞胚胎,其中的任一种可通过任何方便的方式从例如已经体内成熟的卵母细胞或已经体外成熟的卵母细胞产生。

提供了用于确定一个或多个胚胎或多潜能细胞的发育潜力和/或一个或多个胚胎或多潜能细胞中染色体异常的存在的方法、组合物和试剂盒。这些方法、组合物和试剂盒在体外确定在治疗人类中的不育症中最有用的胚胎和卵母细胞中有用。本发明的这些和其他的对象、优点和特征对本领域那些技术人员来说在阅读如下文更加全面地描述的主题方法和组合物的细节时变得显而易见。